Microbiologie du vin
Bases fondamentales et applications

Les connaissances en microbiologie du vin se sont enrichies ces dernières années grâce aux méthodes d'analyse des génomes microbiens et à leurs applications.

Les progrès portent à la fois sur une description plus complète du système microbien et sur l'interprétation de son fonctionnement pendant la vinification et l'élevage.
Consacré exclusivement aux micro-organismes du vin, Microbiologie du vin : bases fondamentales et applications est le premier ouvrage de synthèse à exposer les bases scientifiques des phénomènes microbiologiques de la vinification et à décrire les applications oenologiques qui en découlent.

S'appuyant sur des données scientifiques récentes, cet ouvrage traite de nombreux aspects fondamentaux :

• l'écosystème microbien du raisin au vin

• les levures et les mécanismes de la fermentation alcoolique

• les bactéries et la fermentation malolactique

• les altérations microbiologiques du vin

• l'utilisation des micro-organismes en oenologie le contrôle microbiologique des vins...

Accessible et pratique, illustré de nombreux exemples précis issus d'expériences de terrain et de laboratoire, cet ouvrage s'adresse à tous les praticiens et professionnels du vin oenologues, producteurs, laboratoires oenologiques, industriels, fournisseurs et distributeurs de produits oenologiques, chercheurs ou étudiants.

Chacun y trouvera l'information qu'il recherche concernant le comportement des micro-organismes qui font le vin ou l'altèrent, et disposera d'une vision globale des pratiques oenologiques et des tendances actuelles.

Sommaire

Pr?ce "'
Chapitre 1

L'?syst? microbien du raisin au vin
1.
Les micro-organismes du raisin .
2.
?olution globale des micro-organismes en vinification traditionnelle
enrouge.................................................... .. 9

3.
L'?lution du syst? microbien pendant la vinification. . . . . . . . . . . . .. 11

3.1.
Incidence du traitement de la vendange sur la microflore du mo?. 11

3.2.
?olution de la population des levures pendant la fermentation
alcoolique. .................................................. .. 12

3.3.
?olution de la population des bact?es pendant la vinification ..... 16

3.4.
L'effet du contenant sur l'?lution des micro-organismes
de la vinification 21

4.
Les micro-organismes pendant l'?vage 22

4.1.Contexteg?ral.......................................... .. 22

4.2.
Notion de viabilit?survie, cultivabilit?24

4.3.
?olution des levures et bact?es pendant l'?vage en barrique 28

4.3.1.Leslevures
.......................................... .. 29

4.3.2.
Les bact?es 32

5.
Interactions entre les micro-organismes du vin 34

5.1.
M?nismes d'interactions identifi? 34

5.1.1.
Interactions entre levures et bact?es lactiques 34

5.1.2.
Interactions entre bact?es lactiques 38

5.1.3.
Interactions entre bact?es lactiques
et bact?es ac?ques 39

5.2.
Les autres interactions mises en ?dence pendant la vinification 40

6.
La vinification: le d?loppement d'un ?syst? microbien 43

R?rences bibliographiques 46

Chapitre 2

La croissance microbienne
: analyse physiologique
et cin?que de la croissance
1.
G?ralit?49

2.
Les outils de l'analyse : 49

2.1.
Les variables de concentration .49

2.2.
Les vitesses 50

2.3.
Les vitesses sp?fiques 50

3.
Analyse de la croissance 51

4.
?ude des relations entre croissance et production 55

5.
Analyse de la fermentation alcoolique en vinification 56

6.
La culture continue 60

6.1.
Analyse th?ique 60

6.2.
Application œnologique 61

6.3.
Les syst?s utilis?en œnologie 62

7.
La mod?sation et les mod?s de croissance 63

R?rences bibliographiques 69

Chapitre 3

Biologie des levures du vin
1.
Les levures:d?nition et classification 71

2.
Structure et fonction de la cellule 77

2.1.
Les enveloppes cellulaires 78

2.1.1.
Laparoi 78

2.1.2.
La membrane 78

2.2.
Le cytoplasme 79

2.2.1.
Le hyaloplasme 79

2.2.2.
Les organites 80

2.3.
Le noyau 81

3.
Les cycles biologiques 81

3.1.
La multiplication v?tative 82

3.1.1.
Le bourgeonnement 82

3.1.2.
La scissiparit?2

3.2.
La multiplication sexu?82

3.3.
Quelques remarques sur le cycle biologique 84

4.
Le m?nisme Killer 85

4.1.
D?nition 85

4.2.
La toxine Killer 85

4.3.
R?it?n vinification 87

5.
La nutrition des levures 88

5.1.
Source de carbone 89

5.1.1.
Les sucres 89

5.1.2.
Les alcools. an
5.1.3.
Les acides organiques: l'acide malique et l'acide ac?que 90

5.1.4.
Le gaz carbonique 90

5.2.
Source d'azote " 91

5.3.
??nts min?ux " 93

5.3.1.
Le phosphore " 93

5.3.2.
Le soufre " 93

5.3.3.
Le potassium " 93

5.3.4.
Les autres m?ux " 94

5.4.
Les vitamines " 94

R?rences bibliographiques 94

Chapitre 4

Saccharomyces cerevisiae et la fermentation alcoolique

1.
Le m?bolisme de la levure " 95

1.1.
Rappels g?raux sur le m?bolisme '" " .95

1.1.1.
Le m?bolisme et l'?rgie 95

1.1.2.
Les enzymes 96

1.1.3.
M?nismes de r?lation des activit?enzymatiques 97

1.1.4.
Les principaux « effets» m?boliques chez les levures: d?nition. 99

1.2.
M?bolisme des sucres 99

1.2.1.
M?bolisme g?ral. , 99

1.2.2.
La fermentation alcoolique 101

1.2.3.
Cycle de Krebs: respiration 103

1.2.4.Fermentationourespiration?
......................... .. 105

1.2.5.
Formation de produits secondaires 108

1.3.
Le m?bolisme azot?109

1.3.1.
Synth? des acides amin? 109

1.3.2.Lecarbamated'?yle................................ .. 110

1.4.
Ar? vari?ux et ar? fermentaires 111

1.4.1.
Ar? vari?ux 112

1.4.2.Ar?
fermentaires. ................................ .. 113

1.5.
M?bolisme des compos?soufr? 116

1.5.1.
Sulfites 116

1.5.2.H2S
116

1.5.3.Mercaptans.
........................................ .. 117

2.
Fonctionnement de la cellule en conditions de vinification et r? des facteurs de l'environnement 117

2.1.
Sch? g?ral de fonctionnement 117

2.2.
R?des facteurs de l'environnement 118

2.2.1.
L'oxyg? 118

2.2.2.
L'azote 121

2.2.3.
La temp?ture 123

2.2.4.
Le pH 127

2.2.5.Lespesticides....................................... .. 128

R?rences bibliographiques 129

Chapitre 5

Les bact?es du vin
1.
Rappelsde cytologiebact?enne.............................. .. 131

1.1.
Le mat?el g?tique 131

1.2.
Les ribosomes , 133

1.3.
Les enveloppes cellulaires 133

1.4.Lecontenucellulaire...................................... .. 136

2.
Laclassificationdesbact?es.................................. .. 136

2.1.
Laclassificationdesbact?eslactiques....................... .. 137

2.2.Laclassificationdesbact?es
ac?ques...................... .. 140

R?rences bibliographiques 142

Chapitre 6

Les m?bolismes des bact?es lactiques du vin
1.
La fermentation des sucres 144

2.
Le m?bolisme de l'acide malique et de l'acide citrique. . . . . . . . . . . . .. 146

3.
Le m?bolisme de certains acides amin?150

4.
Les autres activit?enzymatiques des bact?es lactiques importantes
en œnologie 153

4.1.
L'activit?rot?ytique et les peptidases 153

4.2.
Les activit?glycosidases 154

5.
Les apports sensoriels li??'activit?es bact?es lactiques 154

R?rences bibliographiques 157

Chapitre 7

Les facteurs de la croissance
des bact?es lactiques dans le vin

1.
Lanutritiondesbact?es..................................... .. 159

1.1.
Nutrition glucidique 159

1.2.Nutritionazot?
......................................... .. 160

1.3.
Autres facteurs nutritionnels 161

2.
La toxicit?e certains composants du vin
?'?rd des bact?es lactiques 162

3.
Le r?du pH sur la croissance des bact?es lactiques. . . . . . . . . . . . . . .. 164

4.
L'effet de la temp?ture 166

5.
La croissance des bact?es lactiques dans le vin: les conditions
de la fermentation malolactique 167

6.
Observations g?rales 171

R?rences bibliographiques 172

Chapitre 8

Les alt?tions microbiologiques des vins
1.
Les alt?tions par les levures 176

1.1.
Lamaladiedelafleur 176

1.2.
Les levures de re-fermentation 177

2.
Les Brettanomyces et le vin 179

2.1.
G?ralit?179

2.2.
Le d?loppement du d?ut olfactif 185

2.2.1.
La production des ph?ls volatils 185

2.2.2.Les
autres compos?produits par Brettanomyces 189

2.3.
?olution de la concentration en ph?ls volatils des vins
pendantleur?boration...................................... .. 191

3.
D?uts et alt?tions des vins par les bact?es lactiques 197

3.1.
La piq?lactique : 197

3.2.
La « maladie de la graisse» ou « maladie des vins filants ». . . . . . . .. 199

3.3.
La maladie de l'amertume ou piq?acrol?ue 201

3.4.
La maladie de la « tourne» 202

3.5.
La production des amines biog?s 203

3.6.
Les autres m?bolismes d'alt?tion 205

4.
Alt?tions des mo?et des vins par les bact?es ac?ques 206

4.1.
G?ralit?sur les m?bolismes des bact?es ac?ques 206

4.2.
Incidence du d?loppement des bact?es ac?ques sur le raisin
etdansle mo?............................................ .. 211

4.3.
Activit?es bact?es ac?ques dans le vin 212

R?rences bibliographiques 215

Chapitre 9

Les micro-organismes s?ctionn?et leur utilisation en vinification
1.
La souche s?ctionn? utilisation de la diversit?aturelle 217

1.1.
D?nition 217

1.2.
S?ction des levures 218

1.3.
S?ction des bact?es lactiques 220

2.
Les pr?rations commercialis? de levures s?es actives 221

2.1.
Technologie de production des LSA. 222

2.1.1.
Entretien, conservation et pr?ultiplication en laboratoire
des cultures « m? » 222

2.1.2.
Pr?ration des milieux de culture 223

2.1.3.
La multiplication en « fed-batch » 223

2.1.4.
S?ration et granulation des levures 224

2.2.
Contr?de qualit?es LSA 225

3.
L'ensemencement en levures 225

3.1.
Pied-de-cuve ?artir de levures indig?s 226

3.2.
Pied-de-cuve ?artir de levures s?ctionn? 227

3.3.
Utilisation directe des LSA et leur implantation 228

3.4.
Le levurage dans les cas de mac?tion pr?ermentaire ?roid 230

3.5.
Levains et traitement des arr? de fermentation 231

4.
Les levains bact?ens 232

4.1.
Les levains malolactiques « r?tiv? 233

4.2.
Les levains malolactiques pour l'inoculation directe 235

4.3.
Les modes d'utilisation des levains 236

4.3.1.
Quand additionner les levains? 236

4.3.2.
Comment inoculer le vin ? 237

4.4.
Contr?de l'efficacit?u levain 238

R?rences bibliographiques 239

Chapitre 10

Tendances et perspectives dans l'utilisation des micro-organismes en œnologie
1.
Les levains mixtes non-Saccharomyces et Saccharomyces; 241

1.1.
L'importance de ne pas confondre les levures
non-Saccharomyces et les levures d'alt?tion 241

1.2.
Les levures non-Saccharomyces :typicit?icrobiologique
et complexit?romatique 242

1.3.
L'utilisation de la biodiversit?44

2.
Les Schizosaccharomyces et leur utilisation 245

2.1.
Donn? biologiques 245

2.2.
Utilisation de Schizosaccharomyces pombe 246

2.3.
R?ltats obtenus avec la souche G2 246

3.
La co-inoculation levures/bact?es lactiques 247

4.
Les micro-organismes immobilis?249

4.1.
Les proc?s d'immobilisation 250

4.2.
Les applications œnologiques 251

4.2.1.
Prise de mousse pour l'?boration de vins effervescents 251

4.2.2.
D?cidification des mo?de raisin 253

4.2.3.
Traitement des arr? de fermentation
et des fermentations languissantes 254

5.
L'am?oration g?tique des micro-organismes 255

5.1.
Les objectifs 255

5.2.
Le principe de l'am?oration g?tique 256

5.2.1.
Am?oration de Saccharomyces cerevisiae
par croisement (non OGM) 257

5.2.2.Am?oration
g?tique des levures par clonage de g?s (OGM) 258

5.3.
Les principaux objectifs œnologiques pour des levures recombinantes 259

5.4.
Des exemples 260

5.4.1.
L'hyper production de m?bolites de la fermentation 260

5.4.2.
La « levure malolactique » : la premi? levure
transform?g?tiquement pour l'œnologie 261

R?rences bibliographiques 264

Chapitre 11

Les traitements pour la ma?ise des micro-organismes et la stabilit?icrobiologique des vins
1.
Les traitements chimiques 267

1.1.
Le dioxyde de soufre S02 267

1.1.1.
Le S02 dans le vin 267

1.1.2.
Mode d'action du S02 273

1.1.3.
Tol?nce des levures et des bact?es au S02' 273

1.1.4.
Application technologique 274

1.1.5.
Sulfitage du vin pour la stabilisation 277

1.2.
L'acide sorbique 278

1.3.
Le dim?yl dicarbonate (DMDC) 279

1.4.
Le lysozyme 281

2.
Les traitements physiques 282

2.1.
Le traitement par la chaleur: lois de la destruction thermique
et application au traitement des vins (ou des mo? 282

2.1.1.
Lois de la destruction thermique '" 282

2.1.2.
Application au traitement des vins ou des mo?286

2.2.
La filtration 288

2.2.1.
Principes 288

2.2.2.Les
diff?ntes sortes de filtration 289

2.2.3.
L'application des filtrations ?a stabilisation microbiologique . 291

3.
Les autres op?tions 295

3.1.
L'?ulage 295

3.2.
Le pressurage 296

3.3.
L'entonnage 297

3.4.
Les soutirages et la micro-oxyg?tion 297

3.5.
Le collage au blanc d'oeuf 300

R?rences bibliographiques 301

Chapitre 12

Le contr?microbiologique
1.
Le mode de pr?vement des ?antillons 304

2.
Les essais de tenue 305

3.
Les m?odes de la microscopie 305

3.1.
Observation microscopique 306

3.1.1.
Examen ?'?t frais 306

3.1.2.
Coloration de Gram 307

3.2.
Estimation d'une population microbienne 307

3.2.1.
Num?tion directe ?'h?tim?e ou « compte-cellules » 308

3.2.2.Couplage
?ne m?ode d'estimation de la viabilit?10

4.
L'isolement et le d?mbrement des micro-organismes par culture 313

4.1.
Principe et int?t de la m?ode 313

4.2.
Mise en œuvre de la culture sur milieu nutritif g?s?15

4.3.
Les milieux et les conditions de culture 318

4.3.1.
D?mbrement des levures 318

4.3.2.D?mbrement
des bact?es 319

5.
D?loppementsdenouvellesm?odes........................ .. 320

5.1.
Cytom?ie de flux 320

5.2.
La bioluminescence ou « ATPm?ie » et son utilisation en œnologie 321

6.
L'identification par les m?odes de la biologie mol?laire 323

6.1.
Propri?s de la mol?le d'ADN 324

6.1.1.
Rappel sur la structure de l'ADN 324

6.1.2.Lad?turation/renaturation.......................... .. 325

6.1.3.
Hydrolyse de la cha? nucl?ue par les enzymes de restriction. 326

6.1.4.
Synth? d'ADN in vitro par polym?sation de nucl?ides ... 327

6.2.
Principe des m?odes d'identification
par les m?odes mol?laires 328

6.2.1.
L'hybridation ADN/ADN 328

6.2.2.
La PCR ou r?tion de polym?sation en cha? 328

6.2.3.La
PCR quantitative en temps r? 330

6.3.
L'extraction d'ADN pour la PCR 331

6.3.1.
L'extraction directe ?artir de colonies , 331

6.3.2.
L'extraction par le kit FTA (Whatman®) 331

6.3.3.
Autres proc?s 332

6.3.4.Dosage
et conservation des ADN extraits 333

6.4.
?ectrophor? et analyse de l'ADN 333

6.4.1.
L'?ctrophor? c1assiq ue 334

6.4.2.
L'?ctrophor? en conditions d?turantes 335

6.4.3.
L'?ctrophor? en champ puls?38

6.5.
Principales applications ?'identification des esp?s
et des souches de levures et de bact?es lactiques du vin 338

6.5.1.
Identification par PCR et ?ctrophor? classique '" .. , 338

6.5.2.
Identification par PCR et ?ctrophor?
en gel d?turant PCR-DGGE 342

6.5.3.
Identification et d?mbrement par PCR quantitative
en temps r? 344

6.5.4.
Identification par hybridation ADN/ADN 346

6.6.
Identification au niveau des souches 347

6.6.1.
Par PCR 347

6.6.2.
Par PCR en champ puls?49

6.7.
D?ction des levures et des bact?es lactiques d'alt?tion 351

6.7.1.
D?ction de bact?es lactiques d'alt?tion
par hybridation ADN/ADN 352

6.7.2.
D?ction de bact?es lactiques d'alt?tion par PCR , 352

6.8.
Discussion sur les m?odes mol?laires et les choix 354

7.
L'analyse microbiologique depuis la vinification jusqu'?'embouteillage 355

R?rences bibliographiques 359

Index 361